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细胞培养

细胞培养（Cell   culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、PH值和某些营养条件），使之生存、生长、一种复制和保持主要结构和功能的方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，生物学上的正式术语是细胞培养技术。无论对于整个生物工程技术还是生物克隆技术之一，细胞培养都是必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以将一个细胞经过大量培养后转化为简单的单细胞或分化很少的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，细胞培养本身就是细胞克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中一项重要且常用的技术通过细胞培养，可以获得大量的细胞，可以研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞生长和增殖等。 https://www.qwbaike.cn

目录

种类划分 编辑本段

动物细胞培养

在所有的体外细胞培养中，动物细胞培养是最困难的。以下是它需要的特殊条件：

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⑴血清：动物细胞的体外培养经常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于动物细胞体外培养的天然营养液。 Famous Encyclopedia String

⑵支持物：大多数动物细胞都有贴壁的习惯。体外培养常用玻璃塑料等作为支持。 Famous Encyclopedia String

⑶气体交换：在细胞培养过程中要不断调整二氧化碳和氧气的比例，以维持所需的气体条件。

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植物细胞培养

⑴光照：体外培养的植物细胞对光照条件要求不高，因为细胞生长所需的物质主要由培养基供给。然而，光不仅与光合作用有关，还与细胞分化有关例如，光周期可以调节性细胞分化和开花，因此在以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件尤为重要。通过植物细胞的体外培养获得重要物质如药物的过程，其中大多数细胞在反应器中悬浮培养。

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⑵激素：植物细胞的分裂和生长需要植物激素的调节，而促进细胞分裂的生长素和有丝分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂生长分化和个体生长周期受相应的激素调控。相对于动物细胞，植物细胞体外培养的激素需求原理已经了解，其应用技术已经相当成熟，已经有一套可用的培养基。同时解决了植物细胞对水敏感的问题、营养物、激素、渗透压、酸碱度、对微量元素的需求等。

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微生物细胞培养

微生物多为单细胞生物，野外生存条件较为简单。因此，人工培养微生物的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物的培养比好氧微生物更复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧惰性气体的浓度，而好氧微生物只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件的要求不如动植物细胞和玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏成为微生物良好的天然培养基。对于一些特殊微生物的营养需求，可以在这些天然培养基的基础上添加。

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环境条件 编辑本段

环境因素

1．无菌环境

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无毒和无菌是细胞体外培养的首要条件。在体内，解毒系统和免疫系统可以抵御微生物或其他有害物质的入侵，但在体外培养过程中，细胞缺乏免疫系统的保护，失去了对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。为了保证细胞能够在体外生长繁殖，需要保证无菌的工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂培养基和无菌操作。 Famous Encyclopedia String

常见的微生物污染是支原体、细菌、真菌。支原体无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞有潜在影响，但体积小，不易鉴定，可通过地衣红或Hoechst33342染色等方法检测。细菌繁殖很快，可以在短时间内放大，产生毒素杀死细胞。真菌种类很多，肉眼可见，漂浮在培养面上，可呈丝状、管状或树枝状等。

细胞培养细胞培养
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2.合适的温度 Famous Encyclopedia String

一般哺乳动物和鸟类细胞体外培养的适宜温度为37 ~ 38℃，不适宜的环境温度会影响细胞的生长。细胞对低温的耐受性强于对高温的耐受性低温下，细胞的代谢活性和有丝分裂能力下降。如果温度不低于0℃，细胞代谢虽受影响，但无损伤；在25 ~ 35℃时，细胞生长缓慢；但是如果在40℃下放置几个小时，不仅不利于细胞的存活、成长甚至会导致它的死亡。 Famous Encyclopedia String

3.适宜的渗透压 Famous Encyclopedia String

高渗溶液或低渗溶液都会导致细胞折叠、肿胀、破裂。因此，渗透压是细胞体外培养的重要条件之一。大多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受力，在实际应用中为260~320mmol/L的渗透压适用于大多数细胞。

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4．气体环境与pH

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体外细胞培养需要一个理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与了细胞的活动细胞存活的三羧酸循环、新陈代谢和合成提供能量；二氧化碳不仅是细胞的代谢产物，也是细胞生长的必需成分，还与维持培养基的pH值有关。大多数细胞适宜的pH值范围通常是7.2～7.4。在开放文化中，5%二氧化碳气体的比例合适。 Famous Encyclopedia String

营养条件

1．培养基 Famous Encyclopedia String

细胞培养基含有细胞生长所需的各种营养物质，包括碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素等。根据不同细胞的营养需求，有许多合成培养基可供选择，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。

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2．其他添加成分 https://www.qwbaike.cn

除了各种合成培养基提供的基本营养成分外，还需要根据不同的细胞和不同的培养目的添加血清等其他成分、因子等。

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血清提供细胞外基质、胎牛血清常用作生长因子转铁蛋白等重要物质。血清的比例要根据不同的细胞和不同的研究目的来确定。10%～20%血清能维持细胞的快速生长和增殖，称为生长培养基；为了维持细胞的缓慢生长或永生，加2%～5%血清可以称为维持培养基。但血清中也有对细胞生长繁殖有害的物质，如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子；成分不清影响结果分析；不同动物、不同批次的血清活性差异较大，影响培养效果的稳定性。 Famous Encyclopedia String

谷氨酰胺是细胞生长的重要氮源，在细胞生长和代谢过程中起着重要作用但由于谷氨酰胺不稳定，在溶液中易降解，在4℃放置7天，可分解50左右%所以使用前要添加谷氨酰胺。 Famous Encyclopedia String

设施器材 编辑本段

设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。
器材：
一、玻璃器材
培养皿、滴流瓶、刻度吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶
二、塑料器材
多孔培养板、培养皿、培养瓶
三、橡皮器材
橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。
四、金属器材
剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头
五、其他物品
纱布、注射器和针头

一般过程 编辑本段

一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
四、冻存及复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

具体步骤 编辑本段

一、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。
二、细胞传代
细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×10/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。
三、细胞冻存
细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放入液氮，可以保存三个月。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

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